• Выделение изотопномеченых аминокислот из белковых гидролизатов микроорганизмов

    Биомасса микроорганизмов, выращенных на средах, содержащих стабильные изотопы, является ценным источником различных изотопномеченых БАС, в том числе аминокислот. При этом наиболее распространённым и традиционным методом препаративного выделения аминокислот из клеточной биомассы является её гидролиз с использованием ферментативных или химических методов и последующая ионообменная хроматография на катионои анионообменных смолах (дауэкс, амберлит, пермутит, аминекс, дуолит и др.) [133]. Большое значение при проведении гидролиза белка имеет выбор того или иного гидролизирующего агента, который определяется целью исследования.

  • Генно-инженерные методы получения изотопномеченных аминокислот и белков

    Осуществлять направленное биосинтетическое получение индивидуальных белков, меченных стабильными изотопами удобно за счёт использования векторов экспрессии нужных генов, ответственных за биосинтез того или иного интересующего исследователей белка. Оправдано и целесообразно использование для этих целей векторов экспрессии на основе плазмидной ДНК бактерии E. coli, например, вектор экспрессии Т4 лизоцима, включающий в своем составе плазмиду pHSe5 [118]. В результате использования этого вектора экспрессии, были получены миллиграммовые количества Т4-лизоцима, селективно меченного стабильными изотопами азота 15N или углерода 13C. Включение стабильных изотопов в данном случае удалось осуществить за счет роста генного конструкта E. coli на средах, содержащих [15N]или [13С]аминокислоты. Метод также может применяться для получения индивидуальных меченых белков, экспрессия которых происходит в системах, отличных от E. coli, например, системы экспрессии на основе клеток насекомых или млекопитающих [119].

  •                  

  • Использование ауксотрофных мутантов бактерий для получения изотопномеченных аминокислот и белков

    Использование ауксотрофных по определённым аминокислотам форм микроорганизмов для биосинтеза изотопномеченых аминокислот и белков стало настолько популярным в биотехнологии, что сегодня его следует рассматривать как отдельное направление. Селективность мечения белков достигается в результате добавления в ростовую среду меченого аналога соответствующей аминокислоты или её предшественника, по которым штамм ауксотрофен и которые, вследствие этого, непосредственно или через de novo биосинтетический цикл предшественников заменяют в белке нативную аминокислоту. Аналогичный принцип может применяться и при получении изотопномеченых аналогов аминокислот. При этом ауксотрофные штаммы могут относиться к различным таксономическим группам микроорганизмов, включая метаногенные и метилотрофные бактерии, биотехнологический потенциал которых для получения изотопномеченых аминокислот в настоящее время общепризнан. Так, метаногенные бактерии, относящиеся к группе облигатных анаэробов, которые получают энергию за счет ассимиляции газовой смеси (H2-CO2) [88, 89], чаще всего используют для получения [13C]аминокислот. Причём эффективности мечения аминокислот 13С добиваются за счёт получения и использования ацетатзависимых мутантов метаногенных бактерий, неспособных синтезировать ацетил-СоА из СО2 и вследствие этого для роста которых необходим экзогенный ацетат [90].

  • Выращивание микроорганизмов на средах, содержащих стабильные изотопы

    Для многих целей, и прежде всего для структурных исследований белков, биотехнология предлагает альтернативный химическому синтезу путь получения изотопномеченых аминокислот и белков, который приводит к высоким выходам синтезируемых продуктов, к эффективному включению изотопов в молекулы соединений, и, самое главное, к сохранению природной конфигурации (стереоселективности) конечных продуктов [55, 56]. Метод заключается в выращивании штаммов-продуцентов необходимых БАС на ростовых средах, содержащих различные субстраты, представляющие собой органические соединения и неорганические соли, содержащие стабильные изотопы 2Н, 13С, 15N и 18О [57-61].

  • Изотопный обмен в молекулах аминокислот и белков

    Весьма эффективным подходом для препаративного получения [2H]аминокислот является селективное замещение определённых легко обмениваемых на дейтерий ароматических протонов в бензольном кольце фенилаланина и тирозина, в индольном кольце триптофана и в имидазольном кольце гистидина, как в виде индивидуальных аминокислот, так и в составе аминокислотных остатков в белках [47, 48].

    Реакция изотопного (1Н-2Н)-обмена протекает по механизму электрофильного замещения и затрагивает лишь определённые, наиболее чувствительные к замещению протоны в ароматических аминокислотах. Этим методом могут быть получены в граммовых количествах L-[2,3,4,5,6-2Н]фенилаланин в 85% 2H2SO4 при 500 C, L-[3,5-2H]тирозин в 6 н. 2H2SO4 при слабом кипячении раствора, L-[2,4,5,6,7-2H]триптофан в 75% [2H]трифторуксусной кислоте при 250 С и L-[2-2H]гистидин в 6 н. NaO2H при 800 С.

  • Химические синтезы изотопномеченных аминокислот

    Общая стратегия получения изотопномеченых аминокислот и белков показана на рис. 1. Синтетические методы получения изотопномеченых аминокислот представляют собой, как правило, модифицированный классический синтез аминокислот, в котором стадии карбоксилирования, аминирования, восстановления, гидрирования или гидролиза проводят с использованием меченых реагентов, содержащих стабильные изотопы 2Н, 13С, 15N, 18О с соответствующим уровнем изотопной чистоты. В частности, для синтеза [2Н]-, [15N]и [18О]аминокислот используют 2Н2О; 2H2; 2HCl; LiAl2H4; B22H6; 15NH3; Na15NH2; 15NH2Cl, 18H2O и др. (более подробно о методах получения [2H]-и [15N]аминокислот см. обзоры [29, 30]).

  • Введение. Биотехнология

    МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ, МЕЧЕНЫХ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ 2Н, 13С, 15N, 18О

    О. В. МОСИН, Д.А. СКЛАДНЕВ, В.И. ШВЕЦ

    Данный обзор посвящён развитию современных биотехнологических и химико-ферментативных методов по получению аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами 2Н, 13С, 15N, 18О. Рассмотрены потенциальные возможности этих методов для направленного синтеза изотопномеченых аминокислот и белков. Представлены собственные и имеющиеся в литературе данные по получению и использованию синтезированных меченых соединений в разнопрофильных биохимических исследованиях с применением методов спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной (ИК) и лазерной спектроскопии, а также масс-спектрометрии. 

  • Очистка воды от дейтерия в виде тяжелой воды

    Читал о способах очистки тяжелой воды. В основном рекомендуется удалять первый образовавщийся лед. Но в то же время как я понял, этот метод лишь незначительно убирает тяжелую воду, он только позволяет снизить её содержание в талой воде. Может правильнее использовать морозильную камеру с возможностью поддержания постоянной температуры. К примеру выставить 2 градуса цельсия и поставить воду. И по прошествии достаточного периода времени в емкости замерзнет только тяжелая вода(ведь она при 3,8 0С замерзает).

    На самом деле очистка воды от дейтерия в виде тяжелой воды – непростая задача. Тяжёлая вода замерзает при 3,820С, имеет плотность при 200С 1,10539 г/см3, причём максимум плотности приходится не на 40С, как у обычной воды, а на 11,20С (1,10602 г/см3) (Таблица). Кристаллы D2O имеют такую же структуру, как и обычный лёд; различие в размерах элементарной ячейки очень мало (0,1%). Но они более тяжёлые (0,982 г/см3 при 00С по сравнению с 0,917 г/см3 для обычного льда).

  • Полезна ли тяжёлая вода?

    Сообщение:

    Добрый день Только что прочел у вас статью или ответ на вопрос читателя о том , что оказываетья тяжелая вода в меньших количествах полезна... Но если это действительно так, то почему при приготовлении талой воды, при замораживании вы рекомендуете убрать ледяную корочку которая формируется вначале. Это вы говорите именно тяжелая замораживается первой и ее необходимо убрать. Но раз она полезна как ты потом пишете, зачем ее убрать? Может оставить раз так полезна?

    Спасибо

  • Дейтерий-меченый L-фенилаланин для медицинской диагностики

    2006 г. О. В. МОСИН
    Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571, г. Москва, просп. Вернадского, д.86.

    Представлены данные по биосинтезу [2H6] - L-фенилаланина, продуцируемого экзогенно штаммом факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum, способного ассимилировать метанол (или его дейтерий-меченный аналог) в качестве источника углерода и энергии. Микробную биоконверсию C2H3O2H проводили на минимальной среде, содержащей 98 об.% 2Н2O. Выход L-фенилаланина при этом составил 1 г/л. Анализ степени дейтерированности L-фенилаланина проводили методом масс-спектрометрии электронного удара после препаративного разделения методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в виде метилового эфира дансил - фенилаланина и карбобензокси-фенилаланина. Согласно полученным данным, степень изотопного включения дейтерия в фенилаланин составила 75 %, что свидетельствует о высокой эффективности мечения L-фенилаланина в этих условиях. Полученный [2H6]фенилаланин может быть использован для диагностики наследственной фенилкетонурии.

  • Биосинтез аминокислот штаммом Вrevibacterium methylicum

    О. В. МОСИН
    Метод мечения стабильными изотопами является ключевым направлением в разнопрофильных биохимических исследованиях с использованием аминокислот и других биологически активных соединений (БАС) [1,2]. Тенденции к предпочтительному применению стабильных изотопов, в частности, дейтерия по-сравнению с радиоактивными аналогами обусловлены такими их преимуществами, как отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле прямыми методами. Интенсивное развитие изотопно-чувствительной техники, прежде всего спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной и лазерной спектроскопии и масс-спектрометрии (МС), за последние годы позволило значительно усовершенствовать проведение многочисленных биологических исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия клеточных БАС на молекулярном уровне [3,4].

  • Биосинтез инозина высокого уровня дейтерированности

    БИОСИНТЕЗ 2H-МЕЧЕНОГО ИНОЗИНА ВЫСОКОГО УРОВНЯ ДЕЙТЕРИРОВАННОСТИ
    О. В. МОСИН

    В настоящее время во всем мире растет интерес к получению природных биологически активных соединений (БАС), меченных стабильными изотопами (2Н, 13С, 15N, 18О и др), которые необходимы для многочисленных биохимических и диагностических целей [1], структурно-функциональных исследований [2], а также для изучения клеточного метаболизма [3]. Тенденции к предпочтительному использованию стабильных изотопов по сравнению с радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле спектроскопией 1Н ЯМР [4, 5], ИКи лазерной спектроскопией [6], а также масс-спектрометрией [7].

  • Водородный обмен на дейтерий и тритий

    О.В. Мосин
    ВОДОРОДНЫЙ ОБМЕН НА ДЕЙТЕРИЙ И ТРИТИЙ В МАКРОМОЛЕКУЛАХ БЕЛКОВ И ДНК.

    При растворении многих веществ в дейтериевой (D2O) или тритиевой (3Н2О) воде происходит обмен атомов водорода на дейтерий D или тритий 3Н.

    Изотопный обмен характеризуется как самопроизвольное перераспределение изотопов химического элемента между различными фазами системы (в частности, между различными агрегатными состояниями одного и того же вещества), частицами (молекулами, ионами) или внутри молекул (сложных ионов).

    При изотопном обмене сохраняется неизменным элементный состав каждого участвующего в обмене вещества, изменяется лишь его изотопный состав.

  • Метод меченых атомов

    О.В. МОСИН

    Техника меченых атомов приобрела широкую популярность в наше время. Теоретически эта методика очень проста. По существу, она сводится к введению особого изотопа в биологически важный метаболит (или продукт питания), после чего прослеживаются последовательные реакции этого метаболита в организме путем наблюдения за судьбой меченого изотопа в продуктах распада, крови, моче и т.д. На основании этих данных строится метаболизм. Использование меченых изотопов стало возможным благодаря широкому развитию методов получения изотопов.

  • Биостатические эффекты тяжёлой воды в биологических объектах

    О. В. МОСИН, Д.А. СКЛАДНЕВ, В.И. ШВЕЦ.

    Изотоп водорода дейтерий, содержащий в своём ядре один нейтрон, распространённый в природе (природная распространённость дейтерия составляет 0.015%) в виде тяжёлой воды, был открыт в 1939 году. 

    Сразу после открытия этого изотопа учёные начали проводить исследования связанные с ростом клеток на тяжёлой воде, которые привели их к неожиданным результатам. Тяжёлая вода отличается от обычной воды молекулярной массой. В молекуле тяжёлой воды в отличие от обычной воды вместо двух атомов водорода, связанных ковалентной связью с атомом кислорода в молекуле эти два атома водорода замещены на дейтерий. Основной вывод, сделанный учёными был таков - максимальные концентрации тяжёлой воды несовместимы с жизнью и приводят к гибели клетки.

  • Тяжелая вода и адаптация к ней клеток

    О. В. МОСИН

    Тяжёлая вода отличается от обычной воды молекулярной массой. В молекуле тяжёлой воды в отличие от обычной воды вместо двух атомов водорода, связанных ковалентной связью с атомом кислорода в молекуле эти два атома водорода замещены на дейтерий. Атом дейтерия, как изотоп водорода содержит одинаковое количество положительно заряженных частиц протонов, но различается от атома водорода содержанием нейтрально заряженных частиц нейтронов, которых в атоме дейтерия 2. Различие в нуклеарной массе атомов водорода и дейтерия и определяет те гидрофобные эффекты, которые тяжёлая вода оказывает на клетки и организм.

  • Литература к статье Нанотехнология и атомы

    1. Smith K., Barua J. M., Watt P. W. // Am. J. Physiol. - 1992. - V. 262. - N 3. - P. 1372-1376.

    2. McIntosh L. P., Dahlquist F. W. // Quarterly Reviews of Biophysics. - 1990. - V. 23. - N. 1. - P. 1-38.

    3. Harbison G. S., Smith S. O., Pardoen J. A., Mulder P. P. J., Lugtenburg J., Herzfeld R., Mathies R., Griffin R. G. // Biochemistry. - 1984. - V. 23. - P. 2662-2667.

    4. Ames J. B., Ros M., Raap J., Lugtenburg J., Mathies R. A. // Biochemistry. - 1992. - V. 31. -P. 5328-5335.

    5. Fischer M. R., de Groot H. J. M., Raap J., Winkel C., Hoff A. J., Lugtenburg J. // Biochemistry. - 1992. - V. 31. - P. 11038-11043. 

  • Нанотехнология и атомы

    НАНОТЕХНОЛОГИЯ И ВКЛЮЧЕНИЕ АТОМОВ ДЕЙТЕРИЯ, УГЛЕРОДА-13, АЗОТА-15, И КИСЛОРОДА-18 В МОЛЕКУЛЫ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ.

    О. В. МОСИН

    Статья посвящена развитию современных биотехнологических и химико-ферментативных методов по включению атомов дейтерия, углерода-13, азота-15 и кислорода-18 в молекулы аминокислот и белков. Рассмотрены потенциальные возможности этих методов для направленного синтеза изотопномеченых молекул аминокислот и белков. Представлены собственные и имеющиеся в литературе данные по получению и использованию синтезированных меченых соединений в разнопрофильных биохимических исследованиях с применением методов спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной (ИК) и лазерной спектроскопии, а также масс-спектрометрии. 

  • Обычная, тяжёлая, сверхтяжёлая и тяжёлокислородная вода

    До XIX века люди считали воду обычным химическим элементом. В 1805 году Александр Гумбольдт и Жозеф Луи Гей-Люссак установили, что вода состоит из молекул, каждая из которых содержит два атома водорода и один кислорода и считалось, что вода - индивидуальное соединение, описываемое единственно возможной формулой.

    В 1932 году мир облетела сенсация: кроме воды обычной, в природе существует еще и тяжелая вода. В молекулах такой воды место водорода занимает его тяжелый изотоп - дейтерий. 

    Тяжелую воду открыли американские физики Гаральд Юри и Эльберт Осборн. В 1933 году американец Герберт Льюис совместно с Ричардом Макдональдом впервые выделили ее в чистом виде. 

  • Реликтовая вода

    Все начинается с воды — считал древнегреческий философ Фалес Милетский. Вода — основа эволюции всего живого во Вселенной; без воды не существует жизни.

    Работы по улучшению качества воды ведутся во всех странах мира уже давно. Однако существующие очистительные сооружения и технологии водоподготовки не справляются со своими задачами. Поэтому и возникли различные способы и устройства для доочистки питьевой воды. В общих чертах все эти устройства, какой бы совершенной ни была очистка, ничего не могут поделать с генетической памятью воды, проявляющемся в способности воды сохранять след действия на ее молекулярную структуру всех примесных соединений.