• Физиологическая адаптация нового RuMP штамма

    БИОТЕХНОЛОГИЯ

    О. В. МОСИН
    Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571, Москва, просп. Вернадского, 86.


    Разработан метод физиологической адаптации нового фенилаланин-продуцирующего RuMP штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum к максимальным (98 об.%) концентрациям 2Н2О с целью последующего микробиологического синтеза 2Н-меченого фенилаланина. Метод заключается в последовательом рассеве штамма на агаризованных средах М9 с 2 об.% [U -2Н]MetOH со ступенчато возрастающим градиентом концентрации 2Н2O (от 0 до 98 об.% 2Н2О) и последующей селекцией колоний по признаку устойчивости к 2Н2О. В результате применения разработанного подхода для данного штамма метилотрофных бактерий на среде с 98 об.% 2H2О были отобраны отдельные колонии, сохранившие высокие ростовые и биосинтетические параметры.

  • Выделение изотопно-меченных аминокислот

    В ходе выполнения работы было проведено препаративное разделение аминокислот культуральной жидкости и гидролизатов биомассы метилотрофных бактерий методами обращенно-фазовой ВЭЖХ в виде бензилоксикарбонильных производных аминокислот. Так, дейтерий-меченный фенилаланин был выделен из культуральной жидкости В. methylicum методом обращённо-фазовой ВЭЖХ в виде Z-производного с хроматографической чистотой 99% и выходом 89%.

    Хроматографически чистые 2Н-и 13С-аминокислоты были выделены из гидролизатов биомассы B. methylicum и M. flagellatum в виде их Z-производных в миллиграммовых количествах [8]. Отдельные аминокислоты: фенилаланин и лейцин были также хроматографически выделены из культуральных жидкостей данных штаммов метилотрофных бактерий в виде метиловых эфиров дансил-аминокислот.

  •                  

  • Изучение уровней включения изотопов

    2Ни 13С-меченные аминокислоты в составе гидролизатов белка биомассы были получены в условиях, аналогичных таковым для секретируемых аминокислот (табл. 4). Хотя в таблице 4 приведены данные только для 10 аминокислот, не вызывает сомнения, что в остальных аминокислотах уровни изотопного включения сопоставимы, хотя они не детектируются данным методом. Это предположение подтверждается данными по разделению белковых гидролизатов метилотрофных бактерий методом ионнообменной хроматографии, где детектируется уже 16 аминокислот (см. рис. 3).

    Полученные данные свидетельствуют о возможности достижения максимальных уровней включения стабильных изотопов 2Н-и 13С в аминокислоты. Например, в случае с дейтерированными аминокислотами этого результата удалось достичь за счет адаптации культуры B. methylicum к росту и биосинтезу на среде с максимальной концентрацией 2Н2О. Как видно из табл. 4, при росте B. methylicum на данной среде, содержащей 98 об.% 2Н2О, уровни включения 2Н в остатки глицина, аланина, и фенилаланина составляют 90, 97,5, и 95% соответственно. Как и следовало ожидать, в этих условиях метка распределена равномерно по всем положениям углеродного скелета молекул аминокислот.

  • Изучение уровней включения изотопов 2Н- и 13С в секретируемые аминокислоты метилотрофных бактерий

    Эффективность использования дансильных и Z-производных аминокислот для масс-спектрометрических исследований была показана раннее [10, 16]. В данной работе уровни включения изотопов 2Н-и 13С в мультикомпонентные смеси аминокислот в составе культуральной жидкости и белковых гидролизатов определяли методом масс-спектрометрии электронного удара метиловых эфиров дансил-аминокислот или в виде Z-производных аминокислот после их препаративного разделения методом обращённо-фазовой ВЭЖХ.

    Производные аминокислот получали прямой обработкой препаратов культуральной жидкости и гидролизатов суммарных белков биомассы карбобензоксихлоридом (ZCl) или дансилхлоридом (DnsCl) и диазометаном (CH2N2). Реакцию проводили в щелочной среде в водно-органическом растворителе в соотношении карбобензоксихлорид (дансилхлорид)-аминокислота, равным 2:1 (схема 1).
    Для лизина, гистидина, тирозина, серина, треонина и цистеина наряду с монопроизводными было характерно образование ди-Z-(Dns)-производных: ди-Z,(Dns)-лизина, ди-Z,(Dns)-гистидина, О,N-ди-Z,(Dns)-тирозина, O,N-ди-Z,(Dns)-серина, O,N-ди-Z,(Dns)-треонина и N,S-ди-Z,(Dns)-цистеина (на схеме 1 эти произодные не показаны). Кроме этого, из аргинина синтезировался три-Z,(Dns)-аргинин. 

  • Изучение ростовых характеристик M. flagellatum на средах, содержащих СН3ОН/С2Н3О2Н/13СН3ОН и 2Н2О

    Данные по росту штамма М. flagellatum на минимальных средах, с 1 об.% СН3ОН (С2Н3О2Н/13СН3ОН) и содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды приведены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, на средах, содержащих обычную воду и аналоги метанола С2Н3О2Н и 13СН3ОН выходы микробной биомассы составили 81% и 72% соответственно, а на средах с 74,5 об.% 2Н2О выход биомассы составил 29%, что в 3,4 раза ниже, чем в контрольных экспериментах, когда использовали простую воду и метанол (табл. 1, опыты 1, 3, 8). Как видно из таблицы 1, устойчивый рост у M. flagellatum сохранялся лишь в средах, содержащих меньше чем 74,5 об.% 2Н2О. Выше этой концентрации наблюдалось ингибирование роста.

  • Получение штаммов - продуцентов аминокислот

    Для проведения адаптации был выбран ступенчатый режим увеличения концентрации 2Н2О в ростовых средах, так как мы предположили, что постепенное привыкание организма к 2Н2О будет оказывать благоприятный эффект на адаптацию. Этапы адаптации метилотрофных бактерий к средам, содержащим максимальные концентрации 2Н2О показаны на рис. 1 и схеме. Однако вопреки нашим ожиданиям, штамм облигатных метилотрофных бактерий M. flagellatum обнаружил повышенную чувствительность к тяжёлой воде (ингибирование роста бактерий наблюдалось при концентрациях 2Н2О в среде 74,5 об.%) [3]. Дальнейшие эксперименты по адаптации с данным штаммом метилотрофных бактерий не проводились. В связи с этим в наших экспериментах по изучению уровней включения дейтерия в аминокислоты использовались препараты культуральной жидкости и биомасса M. flagellatum, полученная со среды, содержащей 74,5 об.% 2Н2О и 1 об.% С2Н3О2Н.

  • Условия эксперимента

    Бактериальные штаммы. Исследования проводили с генетически маркированными штаммами метилотрофных бактерий, полученными из коллекции культур Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов:

    1. - Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, лейцинзависимый штамм факультативных метилотрофных бактерий, продуцент L-фенилаланина.

    2. - Methylobacillus flagellatum KT, изолейцинзависимый штамм облигатных метилотрофных бактерий, продуцент L-лейцина.

    В работе использовали 2Н2O (99,9% 2Н), С2Н3О2Н (97,5 % 2Н) и 13СН3ОН (97,5 % 13С), полученные из Российского научно-исследовательского центра “Изотоп” (Санкт-Петербург, РФ), а также N-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (дансилхлорид) (Sigma, CША), карбобензоксихлорид (Войковский химзавод, РФ).

  • Метилотрофные бактерии

    БИОТЕХНОЛОГИЯ

    МЕТИЛОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ - ИСТОЧНИКИ ИЗОТОПНО - МЕЧЕННЫХ 2Ни 13САМИНОКИСЛОТ.

    О.В. МОСИН.
    Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571.

    Изучена возможность использования различных штаммов метилотрофных бактерий для получения аминокислот, меченных стабильными изотопами 2Н и 13С, как секретируемыми в культуральную жидкость в процессе ферментации штаммов-продуцентов, так и выделяемыми из гидролизатов суммарного белка биомассы. Представлены данные по адаптации L-фенилаланин-продуцирующего штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum к ростовым средам, содержащим 2 об.% С2Н3О2Н и 98 об.% 2Н2О и биосинтезу L-фенилаланина. Для L-лейцин-продуцирующего штамма облигатных метилотрофных бактерий Methylobacillus flagellatum проведено культивирование на среде, содержащей 1 об.% 13СН3ОН и 99 об.% Н2О. Уровни изотопного включения 2Ни 13С в аминокислоты были изучены методом масс-спектрометрии электронного удара в виде метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных (дансильных) производных аминокислот и бензилоксикарбонильных производных (Z-производных) аминокислот. Максимальные уровни включения стабильных изотопов 2Н-и 13С в аминокислоты при росте метилотрофных бактерий на средах, содержащих 2 об. % СН3ОН и 98 об.% 2Н2O, и 1 об.% 13CH3OH и 99 об.% Н2О составляют 97,5% и 95% соответственно. 

  • Литература к данному разделу

    1. Smith K., Barua J. M., Watt P. W. // Am. J. Physiol. - 1992. - V. 262. - N 3. - P. 1372-1376.
    2. McIntosh L. P., Dahlquist F. W. // Quarterly Reviews of Biophysics. - 1990. - V. 23. - N. 1. - P. 1-38.
    3. Harbison G. S., Smith S. O., Pardoen J. A., Mulder P. P. J., Lugtenburg J., Herzfeld R., Mathies R., Griffin R. G. // Biochemistry. - 1984. - V. 23. - P. 2662-2667.
    4. Ames J. B., Ros M., Raap J., Lugtenburg J., Mathies R. A. // Biochemistry. - 1992. - V. 31. - P. 5328-5335.
    5. Fischer M. R., de Groot H. J. M., Raap J., Winkel C., Hoff A. J., Lugtenburg J. // Biochemistry. - 1992. - V. 31. - P. 11038-11043. 

  • Химико-ферментативный метод

    ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОТОПНОМЕЧЕНЫХ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ

    Другим подходом по получению изотопномеченых аминокислот является химико-ферментативный метод, основанный на комбинации синтетических и ферментативных реакций. Для этого перспективно и экономически оправдано использование препаратов очищенных ферментов и их экстрактов, безклеточных ферментативных систем, а также иммобилизованных ферментов. Ферментативные реакции осуществляют на иммобилизованных ферментах, например, таких как аланиндегидрогеназе (КФ 1.4.1.1) в присутствии NADH при получении [2H]аланина [148], иммобилизованной на сахарозе фенилаланинаммонийлиазе (КФ 4.3.1.5) и фенилаланингидроксилазе (КФ 1.14.16.1), при получении [2H]фенилаланина [149] и [2H]тирозина [150], триптофансинтазе (КФ 4.2.1.20), при получении [2H]триптофана [151], глутаматдегидрогеназе (КФ 1.4.1.2), при получении [2H]глутаминовой кислоты [152], аспартазы (КФ 4.3.1.1), при получении [2Н]аспарагиновой кислоты [153] и серингидроксиметилазе (КФ 2.5.1.6) при получении [2H]серина [154].

  • Выделение изотопномеченых аминокислот из белковых гидролизатов микроорганизмов

    Биомасса микроорганизмов, выращенных на средах, содержащих стабильные изотопы, является ценным источником различных изотопномеченых БАС, в том числе аминокислот. При этом наиболее распространённым и традиционным методом препаративного выделения аминокислот из клеточной биомассы является её гидролиз с использованием ферментативных или химических методов и последующая ионообменная хроматография на катионои анионообменных смолах (дауэкс, амберлит, пермутит, аминекс, дуолит и др.) [133]. Большое значение при проведении гидролиза белка имеет выбор того или иного гидролизирующего агента, который определяется целью исследования.

  • Генно-инженерные методы получения изотопномеченных аминокислот и белков

    Осуществлять направленное биосинтетическое получение индивидуальных белков, меченных стабильными изотопами удобно за счёт использования векторов экспрессии нужных генов, ответственных за биосинтез того или иного интересующего исследователей белка. Оправдано и целесообразно использование для этих целей векторов экспрессии на основе плазмидной ДНК бактерии E. coli, например, вектор экспрессии Т4 лизоцима, включающий в своем составе плазмиду pHSe5 [118]. В результате использования этого вектора экспрессии, были получены миллиграммовые количества Т4-лизоцима, селективно меченного стабильными изотопами азота 15N или углерода 13C. Включение стабильных изотопов в данном случае удалось осуществить за счет роста генного конструкта E. coli на средах, содержащих [15N]или [13С]аминокислоты. Метод также может применяться для получения индивидуальных меченых белков, экспрессия которых происходит в системах, отличных от E. coli, например, системы экспрессии на основе клеток насекомых или млекопитающих [119].

  • Использование ауксотрофных мутантов бактерий для получения изотопномеченных аминокислот и белков

    Использование ауксотрофных по определённым аминокислотам форм микроорганизмов для биосинтеза изотопномеченых аминокислот и белков стало настолько популярным в биотехнологии, что сегодня его следует рассматривать как отдельное направление. Селективность мечения белков достигается в результате добавления в ростовую среду меченого аналога соответствующей аминокислоты или её предшественника, по которым штамм ауксотрофен и которые, вследствие этого, непосредственно или через de novo биосинтетический цикл предшественников заменяют в белке нативную аминокислоту. Аналогичный принцип может применяться и при получении изотопномеченых аналогов аминокислот. При этом ауксотрофные штаммы могут относиться к различным таксономическим группам микроорганизмов, включая метаногенные и метилотрофные бактерии, биотехнологический потенциал которых для получения изотопномеченых аминокислот в настоящее время общепризнан. Так, метаногенные бактерии, относящиеся к группе облигатных анаэробов, которые получают энергию за счет ассимиляции газовой смеси (H2-CO2) [88, 89], чаще всего используют для получения [13C]аминокислот. Причём эффективности мечения аминокислот 13С добиваются за счёт получения и использования ацетатзависимых мутантов метаногенных бактерий, неспособных синтезировать ацетил-СоА из СО2 и вследствие этого для роста которых необходим экзогенный ацетат [90].

  • Выращивание микроорганизмов на средах, содержащих стабильные изотопы

    Для многих целей, и прежде всего для структурных исследований белков, биотехнология предлагает альтернативный химическому синтезу путь получения изотопномеченых аминокислот и белков, который приводит к высоким выходам синтезируемых продуктов, к эффективному включению изотопов в молекулы соединений, и, самое главное, к сохранению природной конфигурации (стереоселективности) конечных продуктов [55, 56]. Метод заключается в выращивании штаммов-продуцентов необходимых БАС на ростовых средах, содержащих различные субстраты, представляющие собой органические соединения и неорганические соли, содержащие стабильные изотопы 2Н, 13С, 15N и 18О [57-61].

  • Изотопный обмен в молекулах аминокислот и белков

    Весьма эффективным подходом для препаративного получения [2H]аминокислот является селективное замещение определённых легко обмениваемых на дейтерий ароматических протонов в бензольном кольце фенилаланина и тирозина, в индольном кольце триптофана и в имидазольном кольце гистидина, как в виде индивидуальных аминокислот, так и в составе аминокислотных остатков в белках [47, 48].

    Реакция изотопного (1Н-2Н)-обмена протекает по механизму электрофильного замещения и затрагивает лишь определённые, наиболее чувствительные к замещению протоны в ароматических аминокислотах. Этим методом могут быть получены в граммовых количествах L-[2,3,4,5,6-2Н]фенилаланин в 85% 2H2SO4 при 500 C, L-[3,5-2H]тирозин в 6 н. 2H2SO4 при слабом кипячении раствора, L-[2,4,5,6,7-2H]триптофан в 75% [2H]трифторуксусной кислоте при 250 С и L-[2-2H]гистидин в 6 н. NaO2H при 800 С.

  • Химические синтезы изотопномеченных аминокислот

    Общая стратегия получения изотопномеченых аминокислот и белков показана на рис. 1. Синтетические методы получения изотопномеченых аминокислот представляют собой, как правило, модифицированный классический синтез аминокислот, в котором стадии карбоксилирования, аминирования, восстановления, гидрирования или гидролиза проводят с использованием меченых реагентов, содержащих стабильные изотопы 2Н, 13С, 15N, 18О с соответствующим уровнем изотопной чистоты. В частности, для синтеза [2Н]-, [15N]и [18О]аминокислот используют 2Н2О; 2H2; 2HCl; LiAl2H4; B22H6; 15NH3; Na15NH2; 15NH2Cl, 18H2O и др. (более подробно о методах получения [2H]-и [15N]аминокислот см. обзоры [29, 30]).

  • Введение. Биотехнология

    МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ, МЕЧЕНЫХ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ 2Н, 13С, 15N, 18О

    О. В. МОСИН, Д.А. СКЛАДНЕВ, В.И. ШВЕЦ

    Данный обзор посвящён развитию современных биотехнологических и химико-ферментативных методов по получению аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами 2Н, 13С, 15N, 18О. Рассмотрены потенциальные возможности этих методов для направленного синтеза изотопномеченых аминокислот и белков. Представлены собственные и имеющиеся в литературе данные по получению и использованию синтезированных меченых соединений в разнопрофильных биохимических исследованиях с применением методов спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной (ИК) и лазерной спектроскопии, а также масс-спектрометрии. 

  • Очистка воды от дейтерия в виде тяжелой воды

    Читал о способах очистки тяжелой воды. В основном рекомендуется удалять первый образовавщийся лед. Но в то же время как я понял, этот метод лишь незначительно убирает тяжелую воду, он только позволяет снизить её содержание в талой воде. Может правильнее использовать морозильную камеру с возможностью поддержания постоянной температуры. К примеру выставить 2 градуса цельсия и поставить воду. И по прошествии достаточного периода времени в емкости замерзнет только тяжелая вода(ведь она при 3,8 0С замерзает).

    На самом деле очистка воды от дейтерия в виде тяжелой воды – непростая задача. Тяжёлая вода замерзает при 3,820С, имеет плотность при 200С 1,10539 г/см3, причём максимум плотности приходится не на 40С, как у обычной воды, а на 11,20С (1,10602 г/см3) (Таблица). Кристаллы D2O имеют такую же структуру, как и обычный лёд; различие в размерах элементарной ячейки очень мало (0,1%). Но они более тяжёлые (0,982 г/см3 при 00С по сравнению с 0,917 г/см3 для обычного льда).

  • Полезна ли тяжёлая вода?

    Сообщение:

    Добрый день Только что прочел у вас статью или ответ на вопрос читателя о том , что оказываетья тяжелая вода в меньших количествах полезна... Но если это действительно так, то почему при приготовлении талой воды, при замораживании вы рекомендуете убрать ледяную корочку которая формируется вначале. Это вы говорите именно тяжелая замораживается первой и ее необходимо убрать. Но раз она полезна как ты потом пишете, зачем ее убрать? Может оставить раз так полезна?

    Спасибо

  • Дейтерий-меченый L-фенилаланин для медицинской диагностики

    2006 г. О. В. МОСИН
    Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571, г. Москва, просп. Вернадского, д.86.

    Представлены данные по биосинтезу [2H6] - L-фенилаланина, продуцируемого экзогенно штаммом факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum, способного ассимилировать метанол (или его дейтерий-меченный аналог) в качестве источника углерода и энергии. Микробную биоконверсию C2H3O2H проводили на минимальной среде, содержащей 98 об.% 2Н2O. Выход L-фенилаланина при этом составил 1 г/л. Анализ степени дейтерированности L-фенилаланина проводили методом масс-спектрометрии электронного удара после препаративного разделения методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в виде метилового эфира дансил - фенилаланина и карбобензокси-фенилаланина. Согласно полученным данным, степень изотопного включения дейтерия в фенилаланин составила 75 %, что свидетельствует о высокой эффективности мечения L-фенилаланина в этих условиях. Полученный [2H6]фенилаланин может быть использован для диагностики наследственной фенилкетонурии.