Водородный обмен на дейтерий и тритий

О.В. Мосин
ВОДОРОДНЫЙ ОБМЕН НА ДЕЙТЕРИЙ И ТРИТИЙ В МАКРОМОЛЕКУЛАХ БЕЛКОВ И ДНК.

При растворении многих веществ в дейтериевой (D2O) или тритиевой (3Н2О) воде происходит обмен атомов водорода на дейтерий D или тритий 3Н.

Изотопный обмен характеризуется как самопроизвольное перераспределение изотопов химического элемента между различными фазами системы (в частности, между различными агрегатными состояниями одного и того же вещества), частицами (молекулами, ионами) или внутри молекул (сложных ионов).

При изотопном обмене сохраняется неизменным элементный состав каждого участвующего в обмене вещества, изменяется лишь его изотопный состав.

Распределение изотопов между веществами в состоянии равновесия характеризуется коэффициентом распределения, определяющим соотношение равновесных концентраций изотопов в реагирующих веществах. При равномерном распределении изотопов коэффициент распределения равен 1.

Однако, на практике равномерное распределение изотопов в реагирующих веществах происходит только для изотопов лёгких элементов.

Для лёгких изотопов углерода, азота и кислорода с небольшими разницами атомных масс при достижении химического равновесия изотопного обмена каждый изотоп распределяется между реагирующими веществами равномерно.

Для изотопов тяжёлых элементов дейтерия и трития эта неравномерность в распределении между некоторыми веществами может достигатьсотен процентов.

Отклонение от равномерного распределения зависит не только от массы изотопов, но и от химического состава веществ, между которыми происходит изотопный обмен. Кроме того, коэффициент распределения зависит от температуры и во всех случаях по мере её повышения приближается к 1.

Скорость протекания изотопного обмена определяется механизмом реакций. В некоторых случаях изотопный обмен протекает практически мгновенно (например, при ионных реакциях в растворе), в других случаях — крайне медленно или же не происходит вовсе. Для ускорения изотопного обмена так же, как и для других химических реакций, часто используют различные катализаторы.

Так, при помещении молекулы в тяжёлую/тритиевую воду происходит довольно быстрый изотопный (Н-D-T)-обмен протонов на дейтерий/тритий в гидроксильных -ОН, карбоксильных -СООН, сульфгидрильных –SH, аминогруппах –NH2 и амидных –NH всех органических соединений, включая нуклеиновые кислоты, липиды, белки и сахара. Известно, что в этих условиях только С-Н связь не подвергается изотопному обмену и вследствие этого только соединения со связями типа С-D (С-T) могут синтезироваться de novo.

При помещении молекулы в тяжёлую/тритиевую воду происходит быстрый изотопный (1Н-2H-3Н)-обмен в гидроксильных -ОН, карбоксильных -СООН, сульфгидрильных –SH, аминогруппах –NH2 и амидных –NH всех органических соединений, включая нуклеиновые кислоты, липиды, белки и сахара. Известно, что в этих условиях только С-Н связь не подвергается изотопному обмену и вследствие этого только соединения со связями типа С-2H (С-3H) могут синтезироваться de novo.

Кроме вышеобозначенных эффектов, возможное изменение энергетики самой дейтериевой/тритиевой связи, что может сказаться на стабильность макромолекул. Изотопные эффекты дейтерия и трития связаны с образованием в тяжёлой/тритиевой воде конформаций молекул с иными структурно-динамическими свойствами, чем конформаций, образованных с участием водорода, и поэтому имеющих другую активность и биологические свойства. Так, в случае с дейтерием разрыв С1H-связей может происходить быстрее, чем С2H-связей, подвижность дейтерия меньше, чем подвижность протия, константа ионизации тяжёлой воды несколько меньше константы ионизации обычной воды. Изотопные эффекты дейтерия и трития связаны с их увеличенной массой по сравнению с протием и вследствие этого с кинетикой реакций, подвижностью, энергетикой и т.д.

Аминокислоты, нуклеозиды, короткие полипептиды, белки в конформации беспорядочного клубка и одноцепочечные нуклеино вые кислоты быстро обменивают атомы водорода, связанные с ато мами азота, кислорода и серы; атомы водорода, связанные с ато мами углерода, обмениваются гораздо медленнее.

В белках, в силу их химических свойств, способные к обмену протоны боко вых групп некоторых аминокислот (например гидрокси-группа ОН серина и амино-группа NH2 глутамина и аспарагина) обмениваются намного быстрее, чем протоны пептидной связи или амидных групп глутамина и аспарагина. Эти два класса протонов – при гидроксиаминной и амидной группах различают по рН-зависимости скоростей водородного обмена — первый класс имеет минимум при рН 7, второй — при рН 3. Каждый класс протонов можно подразделить по принципу степени участия протонов в образовании водородных связей.

Поскольку скорость водородного обмена обычно гораздо меньше, чем скорость образования и разрыва водородных связей (которая контролирует доступ растворителя к группам, участ вующим в образовании водородных связей), наблюдаемая ско рость водородного обмена для любой группы есть произведение скорости водородного обмена на долю времени, в те чение которого группа доступна растворителю. Таким образом, если протоны группы участвует в образовании водородной связи, то это должно приводить к понижению скорости водородного обмена.

Это происходит потому, что протоны в данных группах подвергается действию растворителя только тогда, когда имеет место локальный разрыв водородных связей. Следовательно, измеряя скорости водородного обмена для протонов открытых групп (например, в мономерах) и скорости обмена для аналогичных групп макромолекулы, можно определить в каждый данный момент времени долю протонов этих групп, не участвующих в образовании водородных связей.

В двухцепочечных нуклеиновых кислотах обмен протонов, участвующих в образовании водородных связей, значительно облегчается при действии агента, который разрывает водородные связи. Протон, потенциально спо собный к быстрому обмену, обменивается плохо, если он образует водородную связь.

Этот факт можно использовать для определе ния числа водородных связей, эффективности различных денату рирующих агентов или динамического состояния макромолекулы. При первом применении этой методики рассматривали только дейтериевый обмен, потому что 3Н2О была недоступна. Обнару жение дейтерия было очень трудной задачей, которую решали либо масс-спектрометрией, либо путем инфракрасной спектрофотометрии. Как только стала доступной 3Н2О, вместо дейтериевого обмена стали использовать тритиевый, поскольку тритий легко обнаруживать по радиоактивности.

Тритиевый обмен служит методом исследования структуры белка или ДНК. При этом требуется отделение макромолекул от 3Н2О. Такого специфического разделения можно достигнуть с использованием заряженного геля, поскольку 3Н2О сильно удерживается всеми гелями. Если поры геля имеют минимальный размер, макромолекулы выходят из геля без особого труда.

 

Рис. 1. Эксперимент по тритиевому обмену в белках.

Полипролин (А) и РНазу (Б) инкубировали в течение нескольких часов в 3Н2О до достижения максимального обмена. Затем образцы растворяли водой и через различные промежутки времени наносили на колонку с сефадексом G-25 для разделения белка от 3Н2О. На графике А отсутствует тритий, ассоциированный с полипролином, из чего следует, что либо водородный обмен не происходит, либо он происходит очень быстро. На графике Б показано, что в случае с РНКазой тритий связывается с белком. (из работы Englander W., Biochemistry, 2, 798-807 (1965).

Методика тритиевого обмена, в которой используется гель-проникающая хроматография на различных молекулярных ситах типа сефадекс (рис. 1), состоит в следующем. К белку или нуклеиновой кислоте в растворе Н2О добавляют тритиевую воду. Через различные промежутки времени отбирают пробы и помещают их на колонку. 3Н2О сильно задерживается колонкой, в то время как белки и нуклеиновые кислоты быстро проходят через нее. Используя колонку такой длины, что белок или нуклеиновая кис лота проходят через нее за 10 секунд, концентрацию несвязанного трития понижают приблизительно в 108 раз.

Затем с колонки отбирают фрак ции и радиоактивность каждой определяют методом сцинтилляционного счетчика; концентрацию белка или нуклеиновой кислоты определяют спектрофотометрически или с помощью цветных реакций на белок. Так можно измерить число обменявшихся атомов водорода, приходя щееся на единицу массы или на молекулу (если известна моле кулярная масса) как функцию времени.

Методом тритиевого обмена получено несколько важных результатов. Например, установлено, что протоны, участвующие в образова нии водородных связей двухцепочечной ДНК, могут обмениваться. Из данных по кинетике изотопного обмена и равновесному рас пределению изотопов и влиянию на них рН выяснено, что водо родные связи в двухцепочечной ДНК постоянно разрушаются и образуются вновь; этот процесс назвали «дыханием» и предпо ложили, что он лежит в основе возможного механизма таких процессов, как инициация синтеза ДНК и спаривание ДНК — ДНК при генетической рекомбинации.
Другой пример — определение числа водородных связей в тРНК путем измерения доли быстро обмениваемых протонов; эти данные были исполь зованы учёными для подтверждения одной из предложенных структур тРНК.

В изотопных исследованиях с тяжёлой и тритиевой водой часто используют метод изотопного разбавления. Пусть надо проанализировать содержание со единения А в смеси, которую невозможно количественно разде лить на отдельные компоненты.

Эту задачу можно выполнить следующим образом. К смеси добавляют небольшое количество А, содержащего известную примесь радиоактивного изотопа. Единственное условие дальнейшего анализа состоит в том, что бы можно было хотя бы частично отделить из смеси компонент А в чистом виде. Введем коэффициент разбавления, равный от ношению удельной активности изотопа А до разбавления к удельной активности того же изотопа после разбавления. Для стабильных изотопов отношение концентраций конкретного изо топа до и после разбавления во многих случаях можно опреде лить с помощью масс-спектрометра. Исходя из коэффициента разбавления и количества добавленного компонента А, можно рассчитать концентрацию А в исходной смеси.

Метод изотопного разбавления можно использовать, например, для определения общего количества воды в организме. Для этого вводят известное количество воды, содержащей определен ную примесь радиоактивного трития. Через некоторое время, тре буемое для полного смешивания введенной воды с остальной ее частью, отбирают образец сыворотки крови и измеряют в нем удельную активность трития. Если при этом оказалось, что ко эффициент разбавления равен, например, 800, то полное количе ство воды в организме в 800 раз превышает объем воды, введен ной в эксперименте.

Метод изотопного обмена применим для многих биохимических, диагностических и структурно-функциональных исследований макромолекул, в том числе белков и ДНК.

Литература:
Д. Фрайфельдер, Физическая биохимия, М., Мир, 1982).
О.В. Мосин, Д.А. Складнев, В.И. Швец. Биотехнология. 2001, с. 16-32