Исследование степени дейтерированности инозина

Масс-спектр полученного инозина приведен на рис. 4, б относительно контрольного (а) (немеченный инозин). Как видно из рис. 4, присутствие в масс-спектре дейтерированного образца пика, соответствующего катионизированному молекулярному иону инозина МН+. с m /z 274 (вместо m/z 269 в контрольных условиях), а также пиков характерных фрагментов рибозы [C5H9O4]+с m /z 136 (вместо m/z 133) и гипоксантина [C5H4ON4]+ 138 (вместо m/z 136) подтверждает, что степень дейтерированности инозина составляет 5 атомов из 8 детектируемых по скелету молекулы (62,5 % относительно общего количества атомов водорода в молекуле). Из пяти включенных в инозин атомов дейтерия, три локализуются в рибозной части молекулы, и два атома дейтерия - в гипоксантиновом остатке. Кроме этого, в масс-спектрах инозина детектируются пики с m/z 82 и 109, которые соответствуют продуктам распада гипоксантина. 

Рис. 4
При анализе степени дейтерированности инозина учитывались следующие аспекты. Во-первых, вследствие того что протоны (дейтероны) в С’1-С’5 положениях рибозной части молекулы инозина могли происходить из глюкозы, авторы предположили,что характер биосинтетического включения дейтерия в рибозной части молекулы инозина определяется в основном функционированием ряда процессов гексозомонофосфатного ГМФ-шунта, связанных непосредственно с ассимиляцией глюкозы и других сахаров. Во-вторых, многочисленные обменные процессы и внутримолекулярные перегруппировки, происходящие с участием 2Н2O также могли приводить к специфическому включению метки по определенным позициям в молекуле инозина.Такими доступными позициями в молекуле инозина признаны прежде всего гидроксильные протоны -ОН и протоны при гетероатомах -NH (последние могут обмениваться на дейтерий в 2Н2O за счет кето-енольной таутомерии). Три атома дейтерия в рибозном остатке молекулы инозина могли происходить за счет функционирования многочисленных реакций ГМФ-шунта, два атома дейтерия в гипоксантине также могли синтезироваться de novo.

Преимущества разработанного метода получения высокодейтерированного инозина заключаются в следующих аспектах:

-1. В способности штамма B. subtilis к росту и биосинтезу инозина на среде, содержащей максимальные концентрации тяжелой воды.

-2. Замене необходимых для роста бактерий субстратов на гидролизаты дейтерий-меченной биомассы метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum. При последующих ферментациях в качестве источника ростовых факторов можно использовать ту же дейтерий-меченную биомассу метилотрофных бактерий, либо биомассу самого штамма-продуцента, содержащую в своем составе соединения, которые могут служить источниками углерода и ростовых факторов.

-3. В отсутствие большого количества отходов: согласно схеме дейтерий-меченная биомасса штамма продуцента, предварительно гидролизованная в 2НCl возвращается в цикл в качестве ростовых факторов.

-4. В высокой степени изотопного обогащения дейтерий-меченного инозина.

Таким образом, проведенные исследования подтвердили эффективность данного подхода для препаративного получения высокодейтерированного инозина. Согласно разработанной схеме можно получить несколько граммов дейтерий-меченного инозина с 1 литра культуральной жидкости. Аналогичные подходы по препаративному получению других дейтерий-меченных нуклеозидов в настоящее время активно изучаются.


ЛИТЕРАТУРА
1. Lawrence P. McIntosh and Frederic W. Dahlquist //Quarterly Reviews of Biophysics. - 1990. - V.23. - N.1. - P.1-38.
2. Girishchandra B. Patel, G. Dennis Sprott, and Irena Ekiel. // Appl. and Environ. Microbiology. - 1993. - V.59. - No.4. - P.1099-1103.
3. LeMaster , D.M., and J.E. Cronan.// J. Biol. Chem. - 1982. - V.257. - P.1224-1230.
4. Katz J. and Crespi H.L. // Pure Appl. Chem. - 1972. - V.32. - P. 221-250.
5. Anthony C.// The biochemistry of methylotrophs. - London.:Acad. Press. - 1982. - P.430-500.
6. John Colby, Howard Dalton. // Ann. Rev. Microbiol. - 1979. - V.33. - P.481-517.
7. Webster. I.// Biotechnol. and Bioengeneery.- 1983. - V.25. - C.31-50.
8. Мосин О.В., Карнаухова Е.Н., Пшеничникова А.Б.,Складнев Д.А., Акимова О.Л. // Биотехнология. - 1993. - N.9. - С.16-20.
9. Егорова Т.А., Мосин О.В., Еремин С.В., Карнаухова Е.Н.,Звонкова Е.Н., Швец В.И. // Биотехнология. - 1993. -N.8. - С.21-25.
10. Karnaukhova E.N., Mosin O.V., Reshetova O.S.Biosynthetic production of stable isotope labelled amino acids, using methylotroph Methylobacillus flagellatum. // Amino Acids. - 1993. - V.5. - No.1. - P.125.
11. Миллер Дж. // Эксперименты в молекулярной генетике.- М.:Мир, -1976. - С.393.
12. Karnaukhova E.N., Reshetova O.S., Semenov S.Y., Skladnev D.A., Tsygankov Y.D. // Amino Acids. - 1994. - V.6. - P.165-176.
13. Bligh E.G., Dyer W.J. // Can. J. Biochem. Physiol. - 1959. - V.37. - N.8. - P.911-918.
14. Грачева И.М., Гаврилова Н.Н., Иванова Л.А. //Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. - М.:Пищевая пром-ть, -1980. - С.291-295.
15. Зорина А.В, Бабусенко Е.С. Химический состав биомассы метилотрофных бактерий, современные проблемы биотехнологии микроорганизмов. // Тезисы докл. молодых ученых. - Рига.,1987. -С.35-40.


О. V. MOSIN
Мoscow State Academy of Fine Chemical Technology named after М.V. Lomonosov, 117571.
THE GROWTH OF BACTERIUM OF Basillus subtilis AND BIOSYNTHESIS OF INOSINE ON HIGHLY DEUTERATED MEDIUM.


The possibility for biosynthetic preparation of deuterated inosine obtained from the culture medium of inosine-producing strain B. subtilis was described. The method is based on using the deutero-compounds of facultative methylotrophic bacterium Brevibacterium methylicum obtained from the completely deuterated medium containing 98 v/v% 2Н2O и 2 об. v/v% С2Н3О2Н as a source of growth factors by cultivation of inosine-producing strain. The data on growth of strain of B. subtilis and biosynthesis of inosine on highly deuterated medium containing maximum concentratioms of 2H2O and deutero-compounds extracted from methylotrophic bacteria were described. The evaluation of deuterium enrichment of inosine was carried out using mass-spectrometry FAB. The data obtained testified to a high efficiency of deuterium incorporation into inosine (62,5 % hydrogen atoms are substituted with deuterium in molecule of inosine).