Теперь поговорим о протии и лёгкой воде. Учёные считают, что гравитационное поле Земли – недостаточно сильно для удержания 1Н, и наша планета постепенно теряет протий в результате его диссоциации в межпланетное пространство. Протий улетучивается быстрее тяжелого дейтерия. По мнению некоторых исследований, в течение геологического времени должно происходить накопление дейтерия в атмосфере и в поверхностных водах.
На нашей планете осуществляется гигантский испарительно-конденсационный процесс получения протиевой воды и обогащения его туч и облаков. В горах из них на одних склонах проливается преимущественно дейтерированая вода, на других – вода, обогащенная протием. В организме животных изотопный состав воды близок к составу дождевых вод в местах обитания. Для человека существенные коррективы в эту зависимость вносят овощи и фрукты, выращенные в других климато-географических условиях. Так, тропические фрукты, выращенные близко к экватору, имеют более низкие величины 2Н и 18О. Весь дейтерий в обычной воде находится в форме НDО, а не D2О. Этиловый спирт также хороший накопитель дейтерия.
Обычная питьевая вода только на 99,7% состоит из легкой воды, молекулы которой образованы легкими атомами водорода и кислорода. В виде примеси в любой природной воде присутствует и тяжёлая вода, которая в чистом виде является ядом для всего живого (о ней - соответствующий раздел сайта).
Тяжёлая вода (оксид дейтерия) — имеет ту же химическую формулу, что и обычная вода, но вместо атомов водорода содержит два тяжёлых изотопа водорода — атомы дейтерия. Формула тяжёловодородной воды обычно записывается как: D2O или 2H2O. Внешне тяжёлая вода выглядит как обычная — бесцветная жидкость без вкуса и запаха, а вот по своим физико-химическим свойствам и негативному воздействию на организм тяжёлая вода сильно отличается от лёгкой воды.
Масс-спектр полученного инозина приведен на рис. 4, б относительно контрольного (а) (немеченный инозин). Как видно из рис. 4, присутствие в масс-спектре дейтерированного образца пика, соответствующего катионизированному молекулярному иону инозина МН+. с m /z 274 (вместо m/z 269 в контрольных условиях), а также пиков характерных фрагментов рибозы [C5H9O4]+с m /z 136 (вместо m/z 133) и гипоксантина [C5H4ON4]+ 138 (вместо m/z 136) подтверждает, что степень дейтерированности инозина составляет 5 атомов из 8 детектируемых по скелету молекулы (62,5 % относительно общего количества атомов водорода в молекуле). Из пяти включенных в инозин атомов дейтерия, три локализуются в рибозной части молекулы, и два атома дейтерия - в гипоксантиновом остатке. Кроме этого, в масс-спектрах инозина детектируются пики с m/z 82 и 109, которые соответствуют продуктам распада гипоксантина.
При изучении роста штамма B. subtillis и уровня накопления инозина в КЖ использовали следующие среды:
1). Ферментационная среда (FM-среда), приготовленная стандартно на обычной воде.
2). Ферментационная среда, приготовленная из 99,9 ат.% 2Н2O (dFM-среда) и содержащяя дейтерий-меченную биомассу метилотрофных бактерий, выделенную, соответственно из среды dМ9.
Для получения дейтерий-меченного инозина использовали мутантный штамм B. subtillis (предварительно адаптированный к росту на среде, содержащей максимальные концентрации 2Н2O путём рассева), который вследствие нарушения метаболических путей регуляции биосинтеза пуриновых нуклеотидов продуцирует и выделяет до 20 г инозина на 1 л культуральной жидкости. Иcследуемый штамм проявлял максимальную продуктивность по признаку инозинообразования на богатых ферментационных средах, содержащих в качестве источника углерода и энергии глюкозу (10-12 % от веса), а в качестве источника ростовых факторов и дополнительного источника азота белково-витаминный концентрат (БВК) дрожжей. Ввиду высокой стоимости дейтерий-меченных субстратов, и их малой доступности, было необходимо найти наиболее подходящий природный источник, из которого их можно легко выделять. В качестве такового использовали факультативные метилотрофные бактериии B. methylicum, которые весьма удобны для наработки высокодейтерированных БАС [см. например 8, 9]. Данный штамм метилотрофных бактерий, характеризовался устойчивым ростом и высокими выходами биомассы на среде, содержащей 98 об.% 2Н2О и 2 об.% С2Н3О2Н (см. диаграмму). Именно поэтому мы использовали гидролизаты его биомассы для культивирования штамма продуцента инозина.
Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571.
Изучена возможность биосинтетического получения дейтерий-меченного инозина путём выделения из культуральной жидкости штаммапродуцента Bacillus subtillis. Метод получения инозина основан на использовании в качестве источника ростовых факторов при культивировании штамма-продуцента гидролизатов дейтерированной биомассы факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum, полученных со среды, содержащей 98 об.% 2Н2O и 2 об.% С2Н3О2Н. Приведены экспериментальные данные по росту штамма B. subtilis и биосинтезу инозина на среде, приготовленной из 99,9 ат.% 2Н2О и гидролизатов биомассы метилотрофных бактерий. Анализ степени дейтерированности инозина был проведён с использованием масс-спектрометрии FAB. Полученные результаты свидетельствуют о высокой степени включения дейтерия в инозин (62,5 % атомов водорода в углеродном скелете молекулы замещены на дейтерий).
В настоящей работе уровни включения дейтерия в молекулы аминокислот определяли методом масс-спектрометрии EI MS в виде метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот, за счет сопоставления молекулярных масс протонированных и 2Н-меченых производных аминокислот.
Полученные микробиологическим синтезом 2Н-меченые аминокислоты представляли собой смеси изотопнозамещённых форм молекул, различающихся количеством атомов водорода, замещённых на дейтерий. Вследствие этого эффекта пики молекулярных ионов метиловых эфиров N-Dns-аминокислот в масс-спектрах были полиморфно расщеплены на кластеры за счет примеси молекул с отношениями m/z, больше или меньше детектируемых прибором величин (М)+ с различным вкладом в суммарный уровень дейтерированности.
Во всех экспериментах не зависимо от присутствия 2Н2О в ростовой среде было зафиксировано увеличение продукции фенилаланина на ранней фазе экспоненциального роста, когда выход микробной биомассы был незначителен, в то время как на фазе позднего экспоненциального роста наблюдалось снижение уровня его накопления в ростовой среде.
Для того чтобы объяснить эффект снижения уровня накопления фенилаланина были высказаны возможные предположения о морфологической неоднородности микробной популяции, ингибировании биосинтеза фенилаланина конечным продуктом нарушении транспорта фенилаланина через клеточную мембрану. Результаты по микроскопическому исследованию растущей популяции микроорганизмов показали, что данный характер динамики накопления фенилаланина не коррелировал с качественными изменениями клеточной морфологии на поздних стадиях роста, что служило подтверждением морфологической однородности микробной популяции..
Специальный подход по адаптации заключался в серии из четырех адаптационных пассажей исходной культуры на твёрдых агаризованных средах с 2 об.% [U-2H] MetOH с 0, 24.5, 49, 73.5 и 98 об.% 2Н2О. При этом отбирали отдельные колонии, выросшие на средах с низкими концентрациями 2Н2О. Затем их последовательно пересевали на среды с большей концентрацией 2Н2О, включая среду с 98 об.% 2H2О, проводя их параллельные контрольные рассевы на протонированной среде (степень выживаемости бактерий составила не более 40%).
За ходом адаптации следили по изменениям продолжительности лаг-фазы, времени клеточной генерации и выходов микробной биомассы, а также по максимальному уровню накопления фенилаланина в ростовой среде (рис. 2). Так, выход микробной биомассы, время клеточной генерации и уровень накопления фенилаланина в ростовой среде при росте адаптированного к 2Н2О штамма в 98 об.% 2Н2О изменяются по сравнению с контрольными условиями на 13, .. и 5%, т. е. незначительно (рис. 2, опыт 5’). Продолжительность времени генерации существенно не отличается от исходного штамма на Н2О-среде. Адаптированные к 2Н2О клетки сохранили способность синтезировать и экзогенно продуцировать фенилаланин в ростовую среду, который можно выделять в количестве 0.95 г/л.
Для выращивания штамма был выбран ступенчато-увеличивающийся градиент концентрации 2H2О в ростовых средах в присутствии 2 об.% [U -2H] MetOH, так как предпологалось, что постепенное привыкание клетки к 2Н2О будет оказывать благоприятный эффект на параметры роста и общее самочувствие культуры (таблица). Для компенсации ауксотрофности по лейцину эту аминокислоту добавляли в ростовую среду в протонированном виде в концентрации 10 мг/л.
Сначала исходный штамм выращивали на 2Н2О-содержащих средах без его предварительной адаптации к 2Н2О, для того чтобы определить его ростовые и биосинтетические параметры на этих средах.
О. В. МОСИН Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571, Москва, просп. Вернадского, 86.
Разработан метод физиологической адаптации нового фенилаланин-продуцирующего RuMP штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum к максимальным (98 об.%) концентрациям 2Н2О с целью последующего микробиологического синтеза 2Н-меченого фенилаланина. Метод заключается в последовательом рассеве штамма на агаризованных средах М9 с 2 об.% [U -2Н]MetOH со ступенчато возрастающим градиентом концентрации 2Н2O (от 0 до 98 об.% 2Н2О) и последующей селекцией колоний по признаку устойчивости к 2Н2О. В результате применения разработанного подхода для данного штамма метилотрофных бактерий на среде с 98 об.% 2H2О были отобраны отдельные колонии, сохранившие высокие ростовые и биосинтетические параметры.
В ходе выполнения работы было проведено препаративное разделение аминокислот культуральной жидкости и гидролизатов биомассы метилотрофных бактерий методами обращенно-фазовой ВЭЖХ в виде бензилоксикарбонильных производных аминокислот. Так, дейтерий-меченный фенилаланин был выделен из культуральной жидкости В. methylicum методом обращённо-фазовой ВЭЖХ в виде Z-производного с хроматографической чистотой 99% и выходом 89%.
Хроматографически чистые 2Н-и 13С-аминокислоты были выделены из гидролизатов биомассы B. methylicum и M. flagellatum в виде их Z-производных в миллиграммовых количествах [8]. Отдельные аминокислоты: фенилаланин и лейцин были также хроматографически выделены из культуральных жидкостей данных штаммов метилотрофных бактерий в виде метиловых эфиров дансил-аминокислот.
2Ни 13С-меченные аминокислоты в составе гидролизатов белка биомассы были получены в условиях, аналогичных таковым для секретируемых аминокислот (табл. 4). Хотя в таблице 4 приведены данные только для 10 аминокислот, не вызывает сомнения, что в остальных аминокислотах уровни изотопного включения сопоставимы, хотя они не детектируются данным методом. Это предположение подтверждается данными по разделению белковых гидролизатов метилотрофных бактерий методом ионнообменной хроматографии, где детектируется уже 16 аминокислот (см. рис. 3).
Полученные данные свидетельствуют о возможности достижения максимальных уровней включения стабильных изотопов 2Н-и 13С в аминокислоты. Например, в случае с дейтерированными аминокислотами этого результата удалось достичь за счет адаптации культуры B. methylicum к росту и биосинтезу на среде с максимальной концентрацией 2Н2О. Как видно из табл. 4, при росте B. methylicum на данной среде, содержащей 98 об.% 2Н2О, уровни включения 2Н в остатки глицина, аланина, и фенилаланина составляют 90, 97,5, и 95% соответственно. Как и следовало ожидать, в этих условиях метка распределена равномерно по всем положениям углеродного скелета молекул аминокислот.
Эффективность использования дансильных и Z-производных аминокислот для масс-спектрометрических исследований была показана раннее [10, 16]. В данной работе уровни включения изотопов 2Н-и 13С в мультикомпонентные смеси аминокислот в составе культуральной жидкости и белковых гидролизатов определяли методом масс-спектрометрии электронного удара метиловых эфиров дансил-аминокислот или в виде Z-производных аминокислот после их препаративного разделения методом обращённо-фазовой ВЭЖХ.
Производные аминокислот получали прямой обработкой препаратов культуральной жидкости и гидролизатов суммарных белков биомассы карбобензоксихлоридом (ZCl) или дансилхлоридом (DnsCl) и диазометаном (CH2N2). Реакцию проводили в щелочной среде в водно-органическом растворителе в соотношении карбобензоксихлорид (дансилхлорид)-аминокислота, равным 2:1 (схема 1). Для лизина, гистидина, тирозина, серина, треонина и цистеина наряду с монопроизводными было характерно образование ди-Z-(Dns)-производных: ди-Z,(Dns)-лизина, ди-Z,(Dns)-гистидина, О,N-ди-Z,(Dns)-тирозина, O,N-ди-Z,(Dns)-серина, O,N-ди-Z,(Dns)-треонина и N,S-ди-Z,(Dns)-цистеина (на схеме 1 эти произодные не показаны). Кроме этого, из аргинина синтезировался три-Z,(Dns)-аргинин.
Данные по росту штамма М. flagellatum на минимальных средах, с 1 об.% СН3ОН (С2Н3О2Н/13СН3ОН) и содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды приведены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, на средах, содержащих обычную воду и аналоги метанола С2Н3О2Н и 13СН3ОН выходы микробной биомассы составили 81% и 72% соответственно, а на средах с 74,5 об.% 2Н2О выход биомассы составил 29%, что в 3,4 раза ниже, чем в контрольных экспериментах, когда использовали простую воду и метанол (табл. 1, опыты 1, 3, 8). Как видно из таблицы 1, устойчивый рост у M. flagellatum сохранялся лишь в средах, содержащих меньше чем 74,5 об.% 2Н2О. Выше этой концентрации наблюдалось ингибирование роста.
Для проведения адаптации был выбран ступенчатый режим увеличения концентрации 2Н2О в ростовых средах, так как мы предположили, что постепенное привыкание организма к 2Н2О будет оказывать благоприятный эффект на адаптацию. Этапы адаптации метилотрофных бактерий к средам, содержащим максимальные концентрации 2Н2О показаны на рис. 1 и схеме. Однако вопреки нашим ожиданиям, штамм облигатных метилотрофных бактерий M. flagellatum обнаружил повышенную чувствительность к тяжёлой воде (ингибирование роста бактерий наблюдалось при концентрациях 2Н2О в среде 74,5 об.%) [3]. Дальнейшие эксперименты по адаптации с данным штаммом метилотрофных бактерий не проводились. В связи с этим в наших экспериментах по изучению уровней включения дейтерия в аминокислоты использовались препараты культуральной жидкости и биомасса M. flagellatum, полученная со среды, содержащей 74,5 об.% 2Н2О и 1 об.% С2Н3О2Н.
Бактериальные штаммы. Исследования проводили с генетически маркированными штаммами метилотрофных бактерий, полученными из коллекции культур Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов:
В работе использовали 2Н2O (99,9% 2Н), С2Н3О2Н (97,5 % 2Н) и 13СН3ОН (97,5 % 13С), полученные из Российского научно-исследовательского центра “Изотоп” (Санкт-Петербург, РФ), а также N-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (дансилхлорид) (Sigma, CША), карбобензоксихлорид (Войковский химзавод, РФ).
